Fluorescence მიკროსკოპია: პრინციპები მეთოდი

აბსორბცია და ხელახლა ემისიის მსუბუქი შემდგომი არაორგანული და ორგანული სითხეები არის შედეგი phosphorescence ან ფლუორესცენტული. განსხვავება მოვლენების ხანგრძლივობა შორის ინტერვალი შთანთქმის და ემისიის სინათლის ნაკადად. როდესაც fluorescence ამ პროცესების მოხდეს თითქმის ერთდროულად, ხოლო phosphorescence - გარკვეული დაგვიანებით.

ისტორიული ინფორმაცია

1852 წელს, ბრიტანელი მეცნიერი Stokes, პირველად აღწერილი fluorescence. მან შემოიღო ახალი ტერმინი შედეგად ექსპერიმენტი fluorspar, რომელიც ასხივებენ წითელი შუქი ულტრაიისფერი სინათლე. Stokes აღნიშნა საინტერესო მოვლენაა. აღმოჩნდა, რომ სიგრზის of fluorescent რადიაციული ყოველთვის მეტი ნაკადი აგზნების ნათელი.

იმის დასადასტურებლად, ჰიპოთეზა, მე -19 საუკუნეში არ ყოფილა ბევრი ექსპერიმენტი. ისინი აჩვენა, რომ სხვადასხვა ნიმუშები ფლუორესცენცირებს გავლენის ქვეშ ულტრაიისფერი სინათლე. მასალებს შორის, სხვა საკითხებთან ერთად, იყო კრისტალები, ფისები, მინერალები, ქლოროფილი, ნედლი ნარკოტიკების, არაორგანული ნაერთების, ვიტამინები, ზეთები. პირდაპირი გამოყენების საღებავები ბიოლოგიური ტესტები დაიწყო მხოლოდ 1930 წელს

Fluorescence მიკროსკოპია: აღწერა

ზოგიერთი მასალა, რომელიც გამოიყენება პირველ ნახევარში მე -20 საუკუნის კვლევების გამოფენილი მაღალი სპეციფიკურობა. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. მადლობა შესრულება, რომელიც ვერ მიიღწევა კონტრასტული მეთოდები, მეთოდი fluorescence მიკროსკოპიის გახდა აუცილებელი ინსტრუმენტი ბიოსამედიცინო და ბიოლოგიური კვლევა. გარდა ამისა, მნიშვნელოვანი შედეგები იქნა მიღებული და მასალები.

? რა უპირატესობა აქვს მეთოდით fluorescence მიკროსკოპიის? გამოყენება ახალი მასალები გახდა შესაძლებელი და შერჩევა უაღრესად კონკრეტული უჯრედის submicroscopic კომპონენტები. Fluorescence მიკროსკოპიის შეუძლია აღმოაჩინოს ერთ მოლეკულების. სხვადასხვა საღებავები საშუალებას იდენტიფიკაციის მრავალი საკითხი ერთდროულად. მიუხედავად შეზღუდული სივრცის გაფართოება, რომ დიფრაქციული ზღვარი აღჭურვილობა, რომელიც, თავის მხრივ, დამოკიდებულია კონკრეტული თვისებები ნიმუში, საიდენტიფიკაციო მოლეკულების ქვემოთ ამ დონეზე არის გამორიცხული. სხვადასხვა ნიმუშები დასხივების შემდეგ გამოფენა autofluorescence. ეს მოვლენა ფართოდ გამოიყენება petrology, ბოტანიკის, ნახევარგამტარული ინდუსტრიაში.

მახასიათებლები

სწავლა ცხოველთა ქსოვილებში და პათოგენების ხშირად რთული და ძალიან სუსტი, ან ძალიან ძლიერი არასპეციფიური autofluorescence. თუმცა, ღირებულება კვლევები იძენს შესავალი მასალის კომპონენტები აღფრთოვანებული კონკრეტული სიგრძის და ასხივებენ აუცილებელი მსუბუქი ნაკადის ინტენსივობის. Fluorochromes იმოქმედოს, როგორც საღებავები შეუძლია დამოუკიდებლად ერთვის სტრუქტურების (ხილული და უხილავი). ასე, რომ მათ აქვთ მაღალი შერჩევითობა სამიზნე, და კვანტური სარგებელი.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescence მიკროსკოპიის უკვე ფართოდ გამოიყენება, რადგან მარხვის ბუნებრივი და ხელოვნური საღებავები. მათ ჰქონდათ გარკვეული ინტენსივობით პროფილები გამოტანილ და აგზნების და მიმართულია კონკრეტული ბიოლოგიური ობიექტებზე.

საიდენტიფიკაციო ინდივიდუალური მოლეკულების

ხშირად, იდეალური პირობები, შეგიძლიათ დარეგისტრირდეთ ცალკე ელემენტი glow. ამ, სხვა საკითხებთან ერთად, აუცილებელია, რათა უზრუნველყოს საკმარისად დაბალი ხმაურის დეტექტორი და ოპტიკური ფონზე. ფლუორესცენტული მოლეკულა უკმარისობის გამო photobleaching გადასცემს 300 ათასი. ფოტონები. 20% შეგროვების ეფექტურობის პროცესის და შეგიძლიათ დარეგისტრირდეთ მათ თანხა დაახლოებით 60 ათასი.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescence მიკროსკოპიის საფუძველზე ზვავი photodiodes ან ელექტრონული გამრავლება, საშუალება მისცა მკვლევარებს დაიცვან ქცევის ინდივიდუალური მოლეკულების მეშვეობით მეორე, და რიგ შემთხვევებში კი წუთი.

სირთულის

მთავარი საკითხი სასარგებლოდ ჩახშობა ოპტიკური ხმაურის ფონზე. იმის გამო, რომ ბევრი მასალა გამოიყენება დიზაინი ფილტრები და ლინზები გამოფენებში autofluorescence, ძალისხმევით მეცნიერები ადრეულ ეტაპზე იყო ორიენტირებული წარმოების კომპონენტების მქონე დაბალი fluorescence. თუმცა, მომდევნო ექსპერიმენტი გამოიწვია ახალი დასკვნები. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. კერძოდ, აღმოჩნდა, რომ fluorescence მიკროსკოპიის, ეფუძნება საერთო შიდა ასახვა, ეს საშუალებას იძლევა მივაღწიოთ დაბალი ფონზე და მაღალი ინტენსივობის აგზნების ნათელი.

მექანიზმი

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. პრინციპები fluorescence მიკროსკოპიის, ეფუძნება საერთო შიდა ასახვა გამოყენების evanescent ტალღა ან evanescent. ეს ხდება საზღვრის შორის მედიის სხვადასხვა refractive მაჩვენებლების. ამ შემთხვევაში, სინათლის სხივი გადის ჭრილში. მას აქვს მაღალი refractive ინდექსი პარამეტრი.

პრიზმაში მიმდებარე წყალხსნარში ან მინის დაბალი მაჩვენებელია. თუ სხივი ნათელი მიმართული ეს კუთხე, რომელიც უფრო კრიტიკული, სხივი სრულიად აისახება ინტერფეისი. ეს მოვლენა, თავის მხრივ, იწვევს nonpropagating ტალღები. სხვა სიტყვებით, გენერირებული ელექტრომაგნიტური ველის რომელიც აღწევს შევიდა საშუალო ქვედა refractive ინდექსი პარამეტრი მანძილი არანაკლებ 200 ნმ.

Evanescent ტალღა ინტენსივობის სინათლის იქნება საკმარისი excite fluorophores. თუმცა, იმის გამო, რომ მისი ძალიან მცირე სიღრმე, მისი მოცულობა იქნება ძალიან მცირე. შედეგი არის დაბალი დონის ფონზე.

მოდიფიკაცია

Fluorescence მიკროსკოპიის ეფუძნება საერთო შიდა ასახვა, შეიძლება განხორციელდეს epi-განათება. ეს მოითხოვს ლინზები მაღალი რიცხვითი დიაფრაგმა (მინიმუმ 1.4, მაგრამ სასურველია, რომ მიაღწია 1.45-1.6), და ნაწილობრივ განათებული სფეროში აპარატი. ეს უკანასკნელი მიღწევა პატარა ადგილზე ზომა. მეტი ერთგვაროვნება გამოყენებით თხელი ბეჭედი, რომელიც დაბლოკა ნაწილი ნაკადი. კრიტიკული კუთხით, მას შემდეგ, რაც იქ არის საერთო ასახვა, ჩვენ გვჭირდება მაღალი დონის გარდატეხის ერთი immersion საშუალო ობიექტივი და საფარი მინა მიკროსკოპი.